2021年3月31日浙大城市學院醫學院潘建平教授團隊在病原生物學領域國際頂級期刊PLoS Pathogens在線發表了題為“TcpC inhibits toll-like receptor signaling pathway by serving as an E3 ubiquitin ligase that promotes degradation of myeloid differentiation factor 88”的研究論文。該研究發現尿路致病性大腸埃希菌（uropathogenic E. coli, UPEC）毒力因子TcpC是一種E3泛素連接酶，可以通過促進MyD88泛素化降解，阻斷TLR信號通路，抑制巨噬細胞介導的固有免疫功能，揭示了病原菌逃逸機體固有免疫應答的新機制。

以往研究發現，TcpC因含有TIR結構域，可以直接與TLR競爭結合MyD88，抑制TLR介導的信號途徑，從而抑制巨噬細胞的活化和殺菌功能，利于UPEC在體內的存活，與UPEC所致腎盂腎炎等尿路感染的發生、發展密切相關。

本研究發現，在小鼠腎盂腎炎模型中，與敲除tcpc基因的CFT073突變株（CFT073Δtcpc）組相比，分泌TcpC的CFT073野生株（CFT073wt）組腎臟出現明顯的膿腫和顯著的中性粒細胞浸潤（圖1A-D）；CFT073wt組腎臟巨噬細胞內MyD88蛋白水平顯著下降（圖1E-F）、胞內MyD88與蛋白酶體標志物（PSMD2）的共定位顯著增多（圖1G-I）。

圖1. 腎盂腎炎模型小鼠腎臟巨噬細胞MyD88水平以及與蛋白酶體共定位情況

作者以人巨噬細胞系THP-1、小鼠巨噬細胞系J774A.1和RAW264.7為細胞模型，研究基因重組TcpC蛋白（rTcpC）對巨噬細胞MyD88表達的影響。結果發現，rTcpC能劑量依賴性地抑制巨噬細胞MyD88蛋白水平，但不影響其mRNA水平，提示TcpC能促進MyD88降解。

泛素化是蛋白質翻譯后修飾的重要方式之一，在蛋白質降解、應激反應、細胞周期調節、蛋白質運輸、信號轉導和轉錄調節等過程中發揮重要作用。泛素化過程由一個或多個泛素分子在泛素激活酶（E1）、泛素結合酶（E2）、泛素連接酶（E3）的共同作用下與其它蛋白質分子共價結合并通常降解這些蛋白質。

作者觀察了rTcpC對巨噬細胞MyD88泛素化水平的影響，結果顯示，rTcpC處理能顯著增強巨噬細胞MyD88泛素化水平。生物信息學分析提示TcpC含有HECT家族E3泛素連接酶所具有的結構特征，而人和小鼠MyD88含有HECT家族E3泛素連接酶底物所具有的P-Y基序，提示TcpC可能是一種新的E3泛素連接酶。隨后的體外泛素化實驗證明rTcpC是一種能促進MyD88泛素化的E3泛素連接酶。

為了明確與TcpC結合的E2，作者用抗TcpC抗體Pull-down巨噬細胞中能rTcpC結合的蛋白，獲得PSM>10的4個條帶，經LC-MS/MS分析證實，其中2種蛋白分別是UBE2D1（一種E2）和MyD88。表面等離子共振和等溫滴定量熱法檢測顯示，rTcpC能與UBE2D1和MyD88高親和力結合。

定點突變研究顯示，TcpC中C12和W106是維持其E3泛素化連接酶活性的關鍵位點。

該發現不僅為進一步闡明UPEC的致病性提供了新的實驗依據，而且也是病原菌來源的毒力因子作為E3泛素連接酶，促進MyD88泛素化降解，阻斷TLR信號通路，從而抑制固有免疫細胞活化的首次報道，為進一步闡明病原菌免疫逃逸機制提供了新的線索，具有重要的學術價值。

圖2. TcpC阻斷TLR信號通路分子機制示意圖

博士后方佳琪、碩士生歐茜和博士生潘鋆為論文的共同第一作者，浙大城市學院醫學院潘建平教授、德國海德堡大學Thomas Miethke教授為論文的共同通訊作者。

該研究受到了國家自然科學基金面上項目、浙江省自然科學基金、中國博士后科學基金面上項目的資助。

潘建平教授課題組供稿

轉自/浙大城市學院醫學院